Hold dem KOLDE! Processen med at lave kompetente celler er udfordrende på grund af behovet for, at cellerne skal forblive kolde. Dette er afgørende, fordi cellerne er så følsomme og skrøbelige, mens de bliver gjort kompetente At holde temperaturen lav hjælper med at undgå celledød under behandlingen.
Hvorfor holdes reaktionerne på is under transformationseksperimentet?
Plasmid-celleblandingen opvarmes derefter kortvarigt til 45-50°C, hvilket tillader DNA'et at komme ind i cellen gennem den ødelagte membran. Den opvarmede blanding placeres derefter tilbage på is for at tilbageholde plasmiderne inde i bakterierne … Hvis plasmid-DNA-opløsningen har for meget s alt i sig, kan der opstå buedannelse, hvilket kompromitterer transformationen.
Hvorfor placerer du rørene på is?
Hvorfor tror du, vi lægger rørene på is? For at få DNA'et ind i bakterierne, skal vi stikke huller i dem med det kemiske calciumchlorid (CaCl2). … Hullerne, der er stukket for at tillade DNA'et ind, efterlader bakterierne utætte. Hvis vi ikke holder dem på is, 'bløder' de ihjel.
Hvad er iskoldt calciumchlorids rolle i fremstillingen af kompetente celler?
Processen med calciumchlorid-varmechok-transformation tilskynder bakterieceller til at optage DNA fra det omgivende miljø. … Den iskolde CaCl2-opløsning letter binding af DNA til cellens overflade, som derefter kommer ind i cellen efter en kort periode med varmechok (3).
Hvordan opbevarer du kompetente celler?
Kompetente celler skal opbevares ved - 80°C. Opbevaring ved -20°C vil resultere i et signifikant fald i transformationseffektivitet (TE). Når de blev testet på NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB C2987H), mistede celler 94,5 % af TE efter kun 24 timers opbevaring ved -20°C.
